七子散治疗特发性少弱精症抗凋亡抗氧化的临床应用研究

七子散治疗特发性少弱精症抗凋亡抗氧化的临床应用研究

攀钢集团总医院蒋毅1易正金1王勇1王平1曾祥文1梁华1王久源2攀钢集团总医院男科蒋毅

（1.攀钢集团总医院，四川攀枝花617000；２.成都中医药大学附属医院，四川成都61000） 摘要：目的探索古方七子散治疗特发性少弱精子症抗精子凋亡、抗氧化应激反应的临床疗效与作用机理。方法将67例符合纳入诊断标准的特发性少弱精子症患者随机分为治疗组（43例，服用七子散药粉）治疗组与对照组（34例，口服法地兰联合左卡尼汀），疗程均为3个月，治疗前后观察入观病例的计算机精液常规参数、精子凋亡调控蛋白sFa与精浆超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)，表达水平的变化情况。结果治疗组精子密度、精子活动率（%）、a级精子（%）、a+b级精子（%）以及精浆SOD水平明显改善优于对照组，治疗组精子凋亡调控蛋白sFas下调明显优于对照组。结论古方七子散具有明显的抗氧化抗精子凋亡作用，具有较好的生精作用,从而提高治疗效率，增加妊娠率 .关键词：七子散；SOD；sFas DOI：中图分类号：RR698.2文献标识码：A文章编号： TheClinicalApplicationResearchofUsingtheAncientFormulaPrescriptionQI-ZI-SHANtoTreatIdiopathicOligoasthenospermia,ObservingAntiSpermApoptosis,OxidativeStressReaction JiangYi1,YiZhengjin1,WangYong1,LiangHua1,WangPing1,ZengXiangwen1,WangJiuyuan2 1.DepartmentofUrology&Andrology,theGeneralhospitalofPanzhihuaIron&SteelCompany,Panzhihua617023,China;

2.DepartmentofUrology,AffiliatedHospital,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine. [ABSTRACT]ObjiectiveToresearchthefunctionmechanismofantispermapoptosis,oxidativestressreactionandclinicalcurativeeffectbyuseingtheancientformulaprescriptionQI-ZI-SHANpowdertotreatidiopathicoligoasthenospermia.MethodsThe67patientsinaccordancewiththeinclusioncriteriaforthediagnosisofidiopathicoligoasthenospermiawererandomlydividedintothetreatmentgroup(43cases,treatedbyQI-ZI-SHANpowderfor3months)andthecontrolgroup(34cases,treatedbyclomiphenecombinedwithlevocarnitinealsofor3months).Weobservedandcomparedthedifferencesof2groupsaboutthecomputerroutinesemenparameters,thesFasofthespermandthelevelofSODoftheseminalplasmabeforeandaftertreatment.ResultsAftertreatment,withasignificantdifference(P<0.05),spermactivityrate,agradesperm(%),a&bgradesperm(%)andthelevelofSODoftheseminalplasmainthetreamentgroupwerehigherthanthatinthecontrolgroup.TherewerebetterDownregulationoftheexpressionlevelofthespermsFasofthetreamentgroupthanthecontrolgroup(P<0.05).ConclusionTheancientformulaprescriptionQI-ZI-SHANpowderissuperiortoclomiphenecombinedwithlevocarnitineinthetreatmentofidiopathicoligoasthenospermiabyimprovingthespermactivityrate,agradesperm(%),a&bgradesperm(%)byitsgoodantioxidantandantiapoptosiseffect,alsotoimprovethetreatmentefficiency,increasetherateofpregnancy. [Keywords]Idiopathicoligospermiaandasthenozoospermia;QI-ZI-SHANpowder;Antioxidant;Antiapoptosis 古方七子散源自于唐.孙思邈的《千金翼方》，谓其主治丈夫风虚目暗，精气衰少，无子，补 不足方；特发性少弱精子症是男性不育多发疾病，为此我们开展了古方七子散治疗特发性少弱精子症抗精子凋亡、抗氧化应激反应的临床应用，举得较为满意的临床效果，现报告如下。 1资料与方法 1.1一般临床资料选择2013年9月至2014年12月在攀钢集团总医院泌尿男科门诊就诊符合纳入诊断标准的67例男性不育患者，按分层随机法分为治疗组（七子散组，43例）治疗组与对照组（法地兰联合左卡尼汀口服液组，34例）。 1.2纳入病例标准

（1）夫妇婚后同居1年以上，性生活正常而未采取任何避孕措施，由于男方的原因造成女方不孕，女方的生殖功能检查正常；

（2）根据WHO第五版人类精液检查与处理实验室手册进行标 准的精液分析2次以上，符合：精子浓度＜15×106/ml，精子存活率＜58%，总活力（前向运动精子+非前向运动精子即PR+NP，%）精子 ＜40%或PR级精子＜32%[1]

（3）男科外生殖器检查正常，无明显异常；

（4）年龄控制在25~35岁；

（5）受试者在观察前1个月内未用改善精子数目或活力的中西药物。

（6）中医辨证参照符合肾阳亏虚证型。症见精液清冷，阳痿早泄，性欲减退，腰脊酸痛，神疲乏力，小便频数，夜尿，舌淡，苔薄白，脉沉弱[2]。 1.4排除标准

（1）年龄＜25岁或＞35岁,由于女方原因导致不孕的疾病；

（2）无精症、严重少弱精子症（精子密度＜5×106/ml或精子存活率＜10%或精子活力＜10%）及死精子症患者;

（3）勃起功能与射精功能障碍；

（4）精索静脉曲张及睾丸发育不良（睾丸体积小于12ml）患者;

（5）泌尿生殖系统先天畸形、感染；

（6）染色体或精子发生基因异常、性腺轴检测有明显性腺功能异常;

（7）近期服用过抗癫痫、抗肿瘤等影响生精功能和精子活力的药物；

（8）合并心血管、肝、肾、造血系统严重原发性疾病和精神病患者。

（9）过敏体质或对本药有过敏者;（10）不符合纳入标准、未按规定用药、无法判断疗效或资料不全，影响疗效或安全性判断的患者。 1.5治疗方法：治疗组口服七子散（唐.孙思邈的《千金翼方》），药物组成：牡荆子20g、覆盆子30g、五味子30g、菟丝子30g、车前子10g、菥冥子10g、蛇床子10g、山药10g、石斛30g、熟地黄30g、杜仲20g、鹿茸20g、远志10g、附子6g、川芎10g、山茱萸20g、天雄1g、桂心3g、茯苓10g、川牛膝10g、人参20g、黄芪20g、巴戟天20g、肉苁蓉20g、石钟乳20g，将全部药物烘干粉粹为末，每次5g，3次/d，饭后1小时温开水送服，连续服用3月。对照组：口服法地兰（枸橼酸氯米芬片），50mg/次，1次/d，同时加服左卡尼汀口服液，每次10ml，2次/d（早晚餐时口服），连续服用3月。 1.6观察指标与方法 1.6.1计算机辅助精子动态、形态分析两组分别于治疗前、治疗后进行精液参数分析，评价药物疗效。取精前需禁欲3~5d，手淫取精后置37℃恒温箱（天津市泰斯特仪器有限公司，型号：HHW21-420）内 观察。采用WLJ-9000型伟力彩色精子质量检测系统进行精液参数分析。 1.6.2对精子凋亡调控蛋白sFas表达水平的影响作用

（1）精子的分离：将置于37℃恒温箱的精液离心10min,留取沉淀，用Earle平衡盐缓冲液洗涤2次，调 整精子计数到40×106/ml备用。

（2）精子凋亡调控蛋白sFas表达水平的测定：采用ELISA法测定（sFas双抗体夹心ELISA试剂盒购自日本MBL公司），取出已包被抗人Fas单抗的96孔酶标板，平衡至室温，除空白孔外，分别设立不同浓度的标准孔、空白孔和实验孔；除空白孔外将不同浓度标准品或标本（100μl／孔）加入相应孔中，室温（25℃）孵育2h，使抗原抗体充分反应；洗板，去除游离成分；除空白孔外，每孔同时加入生物素（辣根过氧化物酶）化的抗人Fas抗体（50μl／孔），室温（25℃）孵育1h，产生牢固的免疫复合物；洗板，去除未结合游离成分；加入底物液亲和素过氧化氢和显色剂四甲基联苯胺（100μl／孔），避光室温（25℃）孵育15min，酶－底物充分反应后，加入终止液（1.8N硫酸，100μl／孔），20min内测量纳米光密度（OD450）；sFas与浓度 OD450值间成正比，通过绘制标准曲线图求出标本中sFas浓度。 1.6.2对精浆SOD水平的影响作用：精浆超氧化物歧化酶（SOD）：采用黄嘌呤氧化酶法测定，SOD试剂盒为南京凯基有限公司产品。 1.7统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料用x±s表示,组间比较采用方差分析,计 数资料采用卡方检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。 结果 1对主要精液参数质量的影响作用经过3个月的治疗之后两组精子密度、精子存活率、精子总活力、PR精子百分比均比治疗前有一定程度提高（P＜0.05)，治疗组疗效优于对照组（P＜0.01)，差异有显著性。 表1两组治疗前后精子参数变化比较（x±s） 组别n时间精液量(ml)精子密度精子存活率(%)精子总活力(%)PR精子比例(%) 治疗组45治疗前2.32±0.7213.56±3.3645.62±20.9222.78±11.4917.34±10.82 治疗后3.89±0.67*△19.15±3.21*61.70±16.8*△47.34±12.76*△36.12±11.21*△ 对照组32治疗前2.33±0.5913.31±2.8946.10±27.1323.17±11.2518.21±10.82 治疗后2.89±0.61*17.61±3.11*51.68±23.57*32.29±10.43*28.46±12.11* 注：与治疗前比较，*P＜0.05；与对照组比较，△P＜0.01 2对精子凋亡调控蛋白sFas表达水平的影响作用经过3个月的治疗之后两组sFas表达水平均比治疗前有一定程度提高（P＜0.05)，治疗组抗凋亡能力优于对照组（P＜0.01)，差异有显著性。 表2对精子凋亡调控蛋白sFas表达水平的影响作用（x±s,pg/ml） 组别n治疗前治疗后 治疗组4525.44±4.1619.70±3.81*△ 对照组3224.61±5.6721.30±4.26* 注：与治疗前比较，*P＜0.05；与对照组比较，△P＜0.01 3对精浆SOD水平的影响作用讨论经过3个月的治疗之后两组SOD水平均比治疗前有一定程度提高（P ＜0.05)，治疗组抗氧化能力优于对照组（P＜0.01)，差异有显著性。 表3对精子凋亡调控蛋白SOD表达水平的影响作用（x±s,U/L） 组别n治疗前治疗后 治疗组45115.66±15.71167.32±21.43*△ 对照组32117.58±16.40139.87±20.30* 注：与治疗前比较，*P＜0.05；与对照组比较，△P＜0.01 讨论 sFas及Fas系统是调节机体细胞凋亡的主要基因，sFas介导的异常的细胞凋亡可能是少弱精子症的主要发病原因之一；在生殖系统中，少量持续的活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)是精子受精、获能等生理过程所必需的，起了重要作用，过量的ROS则会引起氧化应激，损伤机体的氧化防御系统。精子膜含有大量多聚脂肪酸，这一特殊结构使精子膜对ROS的水平变化尤其敏感，极易受到ROS的攻击而发生氧化应激损伤，进一步导致精子的凋亡增加，sFas表达上调，影响精子的生成与活力。超氧化物歧化酶Orgotein(SuperoxideDismutase,SOD)是人体精浆中存在的活性氧的酶清除系统。ROS的产生和清除存在着一种平衡，若男性生殖道ROS产生过量，则打破这种平衡，损害精子和精浆的抗氧化防御系统，产生精子的氧化应激损伤，影响精子膜流动性，造成轴丝蛋白质磷酸化程度降低和精子制动，使精子的活动度下降，并可导致精子头部DNA单链的形成和双链的断裂，从而影响精子DNA完整性[3]。 大量的基础及临床研究表明，补肾方能提高在体和离体睾丸间质细胞合成睾酮的能力，并能缓解生精环境的氧化应激损伤，进而改善精液质量，下调sFas，减少生精细胞与精子的凋亡。本研究中天雄、桂心、附片、蛇床子、菟丝子、鹿茸、巴戟天、石钟乳、杜仲补肾壮阳、益元阳体现了形不足者温之以气；鹿茸、熟地黄、菟丝子、山茱萸、五味子、石斛、牡荆子、五味子、菟丝子、菥冥子补肾填精，体现了精不足者补之以味；以山药、人参、黄芪、茯苓补气健脾求生化之源，以川芎、川牛膝活血化瘀，补而不瘀滞；远志为该方特色用药，《别录》言主利丈夫，定惊气，益精；《本经》言其主伤于房中，不足，益智慧，利九窍。方中人参多糖能提高应激大鼠睾丸内雄激素受体的表达和睾酮的生成，淫羊藿、菟丝子、人参、山茱萸、蛇床子及其提取物能促进大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮，从而改善睾丸、附睾功能及精子发生的微环境，从而降低精子的凋亡率，提高精子活率和密度[4,5]。现代药理学研究表明石斛、淫羊藿、蛇床子、熟地黄、枸杞子、黄芪所含多糖类如石斛多糖、地黄多糖、枸杞多糖、黄芪多糖等能够提高SOD活力，减少抗氧化应激损伤，从而改善人精子膜结构和功能的损伤，提高精浆抗氧化酶浓度，降低精浆的高氧化应激状态，从而减少精子的氧化应激损伤、提高活率[6]。上述药物的的抗氧化能力与细胞的凋亡密切相关，可能通过多靶点起作用。同时川牛膝、川芎活血药的使用，符合生殖微循环理论，可以改善睾丸、附睾的微循环，增加生精环境的血液供应，也使得补肾中药中精子生长发育必须的微量元素，得以更大限度地利用。 本研究的作用特点：通过

（1）抗氧化治疗

（2）抗精子凋亡

（3）改善睾丸的生精功能

（4）改善睾丸附睾的微循环达到提高精子数量改善精子活力的作用。 参考文献

1.WorldHealthOrganization.WHOLaboratoryManualfortheExaminationandProcessingof HumanSemen.5thed.Geneva:WorldHealthOrganization,2010.100.

2.郑筱萸.中药新药临床研究指导原则[M].北京：中国医药科技出版社，2002：385~390. 3金伯泉,等.医学免疫学[M].5版,北京:人民卫生出版社,2011:136~152. 4任大全，张艳秋，许志勇，等.补肾益气类中药对古典跤运动员运动性疲劳恢复的研究[J].陕西中医,2009，30（10）1347~1349. 5阴旗俊,孙海峰.蛇床子素的药理作用和作为生物农药的研究[J].中医药信息,2009,26(2):116~119. 6李宝霞,董双涛,等.黄芪多糖抗氧化活性研究[J].山西中医学院学报,2011,12（5）:18~19